MÉTODOS EM FITOPATOLOGIA
Editores: Acelino Couto Alfenas
Reginaldo Gonçalves Mafia
Edição /Ano: 2ª Edição - 2016
ISBN: 978-85-7269-559-6
Páginas: 516
Formato: 17,5 cm x 25,0 cm
Capa: Encadernado / Capa dura
Sobre o Livro :
O ensino da Fitopatologia no Brasil carece de bons livros em língua portuguesa que tratem dos métodos empregados no estudo de doenças de plantas. Assim, este livro foi idealizado para preencher essa lacuna nos cursos de graduação e pós-graduação, complementando em muitos aspectos os poucos manuais existentes no País e no exterior. É inédito, pois contempla as quatro grandes áreas da Fitopatologia: Micologia, Bacteriologia, Nematologia e Virologia, incluindo o emprego de métodos convencionais, moleculares e veículos aéreos não tripulados [drones], empregados no estudo de doenças de plantas. O conteúdo da obra encontra-se didaticamente apresentado e dividido em 15 capítulos, que abordam os princípios e métodos empregados nas quatro áreas citadas. Fornece ainda, aos leitores, os principais métodos para quantificação de doenças e os princípios básicos da fotografia técnica, fotomicrografia, uso de veículos aéreos não tripulados, micrometria óptica, esterilização, preparo de meios de cultura e fatores associados ao cultivo de fitopatógenos, preparo de lâminas e observações microscópicas. Esta segunda edição, revisada e ampliada, contém três novos capítulos que abordam os métodos de diagnose empregados na detecção do apodrecimento do lenho de árvores vivas, identificação de fungos, detecção e identificação de bactérias fitopatogênicas. Para auxiliar os professores e alunos das respectivas disciplinas da área, após cada capítulo há uma relação de exercícios práticos e, após o último capítulo, algumas perguntas e exercícios gerais sobre todo o conteúdo estudado. Os assuntos abordados são úteis a pesquisadores, professores, técnicos e acadêmicos de graduação e pós-graduação que militam nas áreas da Fitopatologia, Agronomia, Engenharia Florestal, Biologia, Botânica, Biotecnologia e áreas afins.
Índice:
1 - ESTERILIZAÇÃO, PREPARO DE MEIOS DE CULTURA E FATORES ASSOCIADOS AO CULTIVO DE FITOPATÓGENOS
1. Introdução – 27
2. Esterilização – 27
2.1. Método físico – 28
2.1.1. Calor – 28
2.1.2. Filtragem – 32
2.1.3. Radiação ultravioleta (UV) – 33
2.1.4. Radiações gama e beta – 33
2.2. Método químico – 34
2.2.1. Gases tóxicos – 34
2.2.2. Soluções desinfestantes – 35
3. Higienização do Laboratório – 36
4. Meios de Cultura – 37
4.1. Classificação dos meios de cultura – 38
4.2. Composição e preparo dos principais meios de cultura – 38
4.2.1. Meios sólidos – 38
4.2.2. Meios líquidos – 46
4.2.3. Meios seletivos para o isolamento de fungos fitopatogênicos e oomicetos – 46
5. Fatores Associados ao Cultivo de Patógenos – 51
5.1. Temperatura – 51
5.2. Luz – 52
5.3. pH – 52
5.4. Aeração – 53
6. Exercícios – 53
7. Referências – 53
2 - ISOLAMENTO DE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS
1. Introdução – 55
2. Métodos básicos de isolamento
2.1. Isolamento direto – 56
2.2. Isolamento indireto – 58
2.2.1. Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos lenhosos ou carnosos (tronco, raízes, galhos grossos e frutos) – 58
2.2.2. Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos não lenhosos ou não carnosos (folhas, ramos finos, radicelas) – 62
3. Métodos Especiais de Isolamento – 64
3.1. Isolamento de fungos de crescimento lento – 64
3.1.1. Isolamento a partir de cirros – 64
3.1.2. Isolamento a partir de ascósporos e basidiósporos ejetados – 65
3.1.3. Isolamento em meio seletivo a partir de tecidos infectados – 67
3.1.4. Sanduíche de cenoura para isolamento de Ceratocystis fimbriata – 68
3.2. Isolamento de fungos de sementes – 70
3.2.1. Fungos externos e internos às sementes – 71
3.2.2. Fungos internos às sementes – 71
3.3. Isolamento de fungos fitopatogênicos do solo – 72
3.3.1. Método de isca qualitativo para Calonectria spp. – 73
3.3.2. Método de isca qualitativo para Rhizoctonia spp. – 75
3.3.3. Método de isca qualiquantitativo para Calonectria spp. e Rhizoctonia spp. – 76
3.3.4. Peneiramento e transferência de solo ou substrato para isolamento de Calonectria spp. e Cylindrocladiella spp. – 79
3.3.5. Oomicetos [Phytophthora spp. e Pythium spp.) – 81
3.4. Isolamento de Ceratocystis fimbriata do solo – 88
4. Exercícios – 89
5. Referências – 91
3 - ARMAZENAMENTO DE MICRORGANISMOS EM CULTURA COM ÊNFASE EM FUNGOS FITOPATOGÊNICOS
1. Repicagens Periódicas – 94
2. Armazenamento em Água (Método de Castellani) – 94
3. Óleo Mineral – 96
4. Armazenamento em Grãos de Cereais – 97
5. Armazenamento em Sílica-Gel – 97
6. Armazenamento em Solo – 98
7. Armazenamento em Nitrogênio Líquido – 99
8. Armazenamento por Congelamento – 100
8.1. Em glicerol – 101
8.2. Armazenamento de bactérias por impregnação – 101
8.3. Em tiras de papel-filtro para fungos – 101
9. Armazenamento por Liofilização – 103
10. Exercícios – 105
11. Referências – 105
4 - PRODUÇÃO, DETERMINAÇÃO E CALIBRAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE INÓCULO EM SUSPENSÃO
1. Introdução – 107
2. Produção de Inóculo – 108
2.1. Produção de esporos – 109
2.1.1. Produção de esporos em meio de cultura – 109
2.1.2. Produção de esporos na planta hospedeira – 111
2.2. Produção de micélio – 112
3. Determinação e Calibração da Concentração de Inóculo – 113
3.1. Determinação e calibração da concentração de inóculo em suspensões de esporos – 113
3.1.1. Hemacitômetro – 113
3.1.2. Contador automático de esporos – 117
3.2. Determinação da concentração e calibração de inóculo para esporos a seco e para micélio triturado – 119
4. Viabilidade do Inóculo – 119
5. Exercícios – 120
6. Referências – 121
5 - INOCULAÇÃO DE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS
1. Introdução – 123
2. Objetivos da Inoculação Artificial – 126
3. Fatores que Afetam a Inoculação – 127
4. Métodos de Inoculação – 130
4.1. Esporos a seco como inóculo – 130
4.2. Suspensão de esporos ou de micélio triturado como inóculo – 131
4.2.1. Fungos não cultiváveis em meios de cultura – 131
4.2.2. Fungos cultiváveis em meios de cultura – 132
4.3. Suspensão de inóculo injetada no caule – 133
4.4. Inoculação com cilindros ou cubos de cultivos artificiais contendo micélio do patógeno – 134
4.5. Infestação de solo e inoculação de raízes – 134
5. Exercícios – 136
6. Referências – 143
6 - DETECÇÃO, ISOLAMENTO E INOCULAÇÃO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS
1. Introdução – 145
2. Detecção de Bactérias Fitopatogênicas – 146
2.1. Detecção de bactérias fitopatogênicas em caules – 146
2.2. Detecção de bactérias fitopatogênicas em folhas – 149
2.3. Outros métodos de detecção de bactérias em plantas – 149
3. Meios de Cultura para Isolamento de Bactérias Fitopatogênicas – 151
4. Métodos de Isolamento – 153
4.1. Isolamento direto – 153
4.2. Isolamento indireto – 156
5. Semeadura da Suspensão de Células em Meio de Cultura Sólido – 157
5.1. Semeadura pelo método de estrias ou riscas – 157
5.2. Semeadura pelo método de diluição em placas – 159
5.3. Semeadura pelo uso de alça de Drigalsky – 160
6. Inoculação de Bactérias Fitopatogênicas – 160
6.1. Preparo do inóculo de bactérias fitopatogênicas – 161
6.2. Quantificação e calibração da concentração de inóculo – 161
6.3. Acondicionamento das plantas antes e depois da inoculação – 162
6.4. Métodos de inoculação – 162
6.4.1. Atomização – 163
6.4.2. Injeção – 163
6.4.3. Imersão de raízes – 164
6.4.4. Outros métodos de inoculação – 165
6.5. Reação de hipersensibilidade (HR) para comprovação de patogenicidade – 167
7. Exercícios – 169
8. Referências – 169
7 - QUANTIFICAÇÃO DE DOENÇAS EM PLANTA
1. Introdução – 171
2. Definições – 172
3. Métodos de Quantificação da Intensidade de Doenças de Plantas – 174
3.1. Quantificação direta – 174
3.1.1. Medição das dimensões, da área, do volume e, ou, do número de lesões – 174
3.1.2. Quantificação direta da severidade propriamente dita – 176
3.2. Escalas descritivas – 176
3.2.1. Nominais – 176
3.2.2. Graus de ”infecção” – 176
3.3. Escalas de notas – 177
3.3.1. Aritméticas – 180
3.3.2. Logarítmicas – 180
3.4. Escalas diagramáticas (chaves de campo) – 181
3.5. Outros métodos – 184
4. Exercícios – 184
5. Referências – 184
8 - PRINCÍPIOS BÁSICOS DA FOTOGRAFIA TÉCNICA, FOTOMICROGRAFIA E MICROMETRIA ÓPTICA
1. Introdução – 187
2. Câmeras Fotográficas – 188
3. Objetivas – 190
3.1. Objetiva normal – 190
3.2. Teleobjetiva – 191
3.3. Grande angular – 191
3.4. Macro-objetiva – 191
3.5. Objetiva zoom – 192
4. Câmeras Embarcadas para Fotos Aéreas em VANTs – 192
5. Composição Fotográfica – 193
6. Informações Úteis – 195
6.1. Eliminação de sombras – 195
6.2. Horário de fotografar – 195
7. Fotomicrografia – 196
7.1. Composição dos microscópios – 196
7.2. Obtenção de fotomicrografias – 197
8. Micrometria – 198
9. Edição de Imagens – 203
10. Exercícios – 204
11. Referências – 205
9 - PREPARAÇÕES E OBSERVAÇÕES MICROSCÓPICAS DE ESPÉCIMES FÚNGICOS
1. Introdução – 207
2. Controle da Iluminação – 208
3. Limpeza das Lentes Microscópicas – 209
4. Preparações Microscópicas – 209
4.1. Preparo de lâminas microscópicas temporárias – 211
4.1.1. Lâminas preparadas com fita adesiva – 211
4.1.2. Lâminas de raspagem – 211
4.1.3. Lâminas de cortes histológicos – 213
4.1.4. Microcultura – 216
4.2. Corantes e técnicas de coloração de núcleos – 217
4.3. Coloração com safranina O – 219
4.4. Coloração pelo método Giemsa – 220
5. Exercícios – 222
6. Referências – 222
10 - MICROSCOPIA E SUAS APLICAÇÕES NO ESTUDO DAS INTERAÇÕES FUNGO-PLANTA
1. Introdução – 225
2. Técnicas Microscópicas – 227
2.1. Microscopia óptica – 227
2.2. Microscopia de fluorescência – 229
2.2.1. Técnicas imunocitoquímicas – 229
2.2.2. Corantes fluorescentes – 230
2.2.3. Proteínas fluorescentes verde, azul e vermelha – 230
2.3. Microscopia de varredura a laser confocal (MVLC) – 231
2.4. Microscopia eletrônica de transmissão - Imunolocalização – 232
2.5. Microscopia crioeletrônica – 233
2.6. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) – 233
2.7. Microscopia eletrônica associada à microanálise por raios X – 233
3. Métodos – 234
3.1. Clareamento e coloração de estruturas fúngicas em folhas – 234
3.1.1. Técnica de clareamento e coloração de fragmentos vegetais de Bruzzese e Hasan (1983) – 235
3.1.2. Técnica de coloração de cortes por ácido periódico-Schiff (Dring, 1955) – 236
3.1.3. Reagente de Bell (Bell, 1951) – 237
3.1.4. Tionina e Orange G (Stoughton, 1930) – 238
3.1.5. Azul-de-toluidina (Ghemawat, 1977) – 238
3.1.6. Clareamento e coloração de estruturas fúngicas em raízes – 239
3.1.7. Clareamento e coloração de estruturas fúngicas em tecidos lenhosos – 241
3.1.8. Coloração de estruturas fúngicas em material embebido em resina (LR White resin ou Spurr’s resin) – 242
3.2. Histoquímica de compostos fenólicos em tecido vegetal – 243
3.2.1. Compostos fenólicos gerais – 243
3.2.1.1. Cloreto de ferro III (Johansen, 1940) – 243
3.2.1.2. Formalina 4% e sulfato ferroso 10% (Johansen, 1940) – 243
3.2.1.3. Dicromato de potássio (Gabe, 1968) – 244
3.2.1.4. Diazorreação (Ganter e Jollés, 1970) – 245
3.2.1.5. Ação de fluorocromos (Charrière-Ladreix, 1976) “em luz ultravioleta” – 245
3.2.2. Taninos - Vanilina clorídrica (Mace e Howell, 1974) – 246
3.2.3. Lignina – 247
3.2.3.1. Floroglucinol (Johansen, 1940) – 247
3.3. Histoquímica de calose em tecido vegetal – 247
3.3.1. Azul-de-anilina (Smith e Mccully, 1978) “em luz azul” – 247
3.3.2. Calcofluor White “em luz ultravioleta” – 248
3.4. Estudo da interação fungo-planta pela introdução de gene repórter – 248
3.4.1. Proteína verde fluorescente para estudos do crescimento e monitoramento de hifas fúngicas – 249
3.4.2. Proteína verde fluorescente para análise da expressão de genes envolvidos na interação fungoplanta e localização de proteínas de interesse – 250
4. Exercícios – 252
5. Referências – 252
11 - MÉTODOS EM NEMATOLOGIA VEGETAL
1. Introdução – 257
2. Amostragem – 258
3. Extração de Nematoides – 261
3.1. Extração de nematoides vermiformes do solo – 262
3.2. Extração de cistos de Heterodera glycines a partir de solo seco (Shepherd, 1970) – 267
3.3. Extração de cistos de Heterodera glycines a partir de solo úmido: método da sacarose densa (Dunn, 1969) – 268
3.4. Extração de nematoides das raízes – 268
3.5. Extração de nematoides de partes aéreas de plantas – 270
4. Preparo de Lâminas – 270
4.1. Preparo de lâminas temporárias (Cobb, 1918) – 270
4.2. Preparo de lâminas permanentes – 271
5. Coloração de Nematoides – 274
5.1. Método de coloração de nematoides no interior do sistema radicular de plantas com fucsina ácida (Byrd et al., 1983) – 274
5.2. Método de coloração de massas de ovos de Meloidogyne spp. com fucsina ácida (Silva et al., 1988) – 276
5.3. Método de coloração de massas de ovos de Meloidogyne spp. com floxina B (Taylor e Sasser, 1978) – 277
5.4. Método de coloração de massas de ovos e ovos de Meloidogyne spp. com corantes da indústria alimentícia (Rocha et al., 2005) – 277
6. Inoculação de Nematoides – 278
6.1. Obtenção de ovos e de juvenis de segundo estádio de Meloidogyne spp. para infestação de solo – 278
6.2. Obtenção de ovos e de juvenis de segundo estádio de Heterodera glycines para infestação de solo – 279
6.3. Calibração de suspensões de ovos de Meloidogyne spp. e de Heterodera glycines, para inoculação – 279
7. Identificação de Espécies e Raças de Meloidogyne spp. – 280
7.1. Identificação de espécies por padrão perineal da fêmea – 280
7.2. Identificação de espécies de Meloidogyne spp. pela eletroforese de isoenzimas – 281
7.3. Identificação de espécies e raças de Meloidogyne spp. por hospedeiros diferenciadores – 291
8. Determinação do índice de Galhas – 292
9. Identificação de Raças de Heterodera glycines – 293
10. Referências – 295
12 - MÉTODOS EM VIROLOGIA VEGETAL
1. Introdução – 297
2. Métodos de Diagnose de Viroses Vegetais – 299
2.1. Determinação da gama de hospedeiros de um vírus – 299
2.2. Teste de imunoadsorção com enzima ligada ao anticorpo (ELISA) – 303
2.3. Reação em cadeia da polimerase (PCR) – 306
2.4. PCR em tempo real – 310
3. Métodos Utilizados para Estudo das Propriedades e dos Componentes da Partícula Viral – 315
3.1. Purificação de vírus de plantas – 315
3.1.1. Purificação de um tobamovírus (TMV) – 319
3.1.2. Purificação de um comovírus (BRMV) – 321
3.2. Eletroforese da proteína capsidial de um vírus – 323
3.3. Purificação e eletroforese do RNA de um vírus – 327
4. Métodos para a Caracterização Molecular de Vírus de Plantas – 330
4.1. Amplificação de fragmentos do genoma viral via RT-PCR – 330
4.2. Extração e amplificação do genoma completo de begomovírus – 334
4.3. Clonagem de fragmento do genoma viral amplificado por RT-PCR – 338
4.3.1. Ligação ao plasmídeo vetor – 338
4.3.2. Transformação de Escherichia coli – 340
4.3.3. Extração de DNA plasmidial por lise alcalina – 342
4.3.4. Análise dos plasmídeos recombinantes – 344
4.4. Sequenciamento de DNA – 345
4.5. Análise de sequências – 347
4.6. Caracterização de proteínas virais supressoras de silenciamento – 349
5. Exercícios – 351
6. Referências – 353
13 - MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DA PODRIDÃO DO LENHO DE ÁRVORES VIVAS
1. Introdução – 355
2. Avaliação da Podridão do Lenho por Métodos Não Destrutivos – 356
2.1. Métodos não invasivos – 357
2.1.1. Análise visual – 357
2.1.2. Tomografia de impulso – 367
2.1.3. Tomografia de impedância elétrica – 370
2.1.4. Extensômetro – 371
2.2. Métodos invasivos – 372
2.2.1. Trado de incremento – 372
2.2.2. Furadeira – 374
2.2.3. Resistógrafo – 374
2.2.4. Raios X – 378
3. Exercícios – 384
4. Referências – 388
14 - PRINCÍPIOS E MÉTODOS PARA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE FUNGOS
1. Introdução – 389
2. Obtenção de Culturas Monospóricas – 390
2.1. Isolamento monospórico – 391
2.2. Isolamento monospórico de fungos que produzem esporos no interior de corpos de frutificação – 392
2.3. Fungos com micélio estéril – 394
3. Extração de DNA – 395
3.1. Extração de DNA por resina – 395
4. PCR – 397
4.1. Variações da PCR – 398
4.1.1. PCR convencional – 398
4.1.2. PCR multiplex – 398
4.1.3. Nested PCR – 399
4.2. Reagentes utilizados na PCR – 399
4.2.1. Taq DNA polimerase – 399
4.2.2. Primers – 400
4.2.3. Desoxirribonucleotídeos fosfatados – 401
4.2.4. MgCl2 – 401
4.2.5. Tampão – 401
4.2.6. Água – 402
4.3. Princípios da PCR – 402
4.3.1. Desnaturação – 402
4.3.2. Anelamento – 402
4.3.3. Extensão – 404
5. Eletroforese – 404
6. Identificação Molecular de Fungos – 405
6.1. Detecção de fungos fitopatogênicos utilizando a PCR – 405
6.1.1. PCR em tempo real – 406
6.2. Sequenciamento – 407
6.2.1. Técnicas de sequenciamento – 407
6.2.2. Verificação dos eletroferogramas e obtenção das sequências consenso – 409
6.3. Comparações de sequências em banco de dados – 410
6.3.1. Blast (“Basic Local Alignment Search Tool”) – 411
6.4. Código de barras para fungos – 413
6.5. Análise filogenética na identificação de fungos – 414
6.5.1. Alinhamento múltiplo de sequências – 415
6.5.2. Principais métodos de reconstrução filogenética – 416
6.5.3. Testes de confiança de topologias – 419
6.5.4. Árvores filogenéticas – 419
7. Exercícios – 420
8. Referências – 421
15 - DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS
1. Introdução – 423
2. Meios Seletivos – 424
3. Métodos Sorológicos – 426
3.1. Produção de anticorpos policlonais – 428
3.2. Produção de anticorpos monoclonais – 429
3.3. Conjugação de anticorpos – 431
4. Principais Métodos Sorológicos – 432
4.1. Imunodifusão radial – 432
4.2. Aglutinação – 433
4.3. Imunofluorescência (IF) – 435
4.4. ELISA – 436
4.5. Testes de fluxo – 438
4.6. Teste de “Pocket Diagnostic®” – 439
4.7. Citometria de fluxo – 440
4.8. Imunocaptura magnética – 441
5. Métodos Moleculares – 442
5.1. Extração de DNA de bactérias – 443
5.2. PCR convencional – 446
6. Variações da Técnica da PCR – 449
6.1. BIO-PCR – 450
6.2. Nested-PCR ou PCR aninhada – 450
6.3. Co-PCR – 450
6.4. Multiplex PCR – 451
6.5. Rep-PCR – 452
6.6. RFLP-PCR – 454
6.7. PCR em tempo real – 454
7. Identificação Baseada em Sequências de DNA – 457
7.1. Sequenciamento de genes – 457
7.2. Sequenciamento de genomas – 464
8. Exercícios – 466
9. Referências – 467
ESTUDO DIRIGIDO – 473
ÍNDICE – 499
